Molekulêre genetyske ûndersyk metoade

Om ferkenne en identifisearje farianten yn DNA struktuer brûkt molekulêre genetyske metoade. Foar eltse DNA regio, dy't ûndersiket dizze streek fan it gromosoom, gene of allele, de metoaden ferskille. Efterlizzende elke molekulêre genetyske metoade bestiet út inkele of oare manipulaasje fan RNA en DNA. Al dizze metoaden ûnderskiede har troch in ûnbidich kompleksiteit, sûnder laboratorium betingsten kinne net útfierd wurde, en it personiel moat wêze heechkwalifisearre. Dat wurk wurdt útfierd yn meardere fazen.

stadia

Earst, RNA of DNA fan gebrûk wurde produsearre. Hjir, in molekulêre genetysk metoade kin tapast wurde om benei eltse materiaal: in dripke bloed, leukocytes, fibroblasts kultuer, mucosa (sloopt), sels de hier follicles, - DNA kinne jo krije by alle stekproef. It is geskikt om te brûken gjin molekulêre genetyske metoaden en harren ferskate opsjes en hawwe lang isolearre DNA wurdt opslein beferzen. De twadde etappe is wijd oan it sammeljen fan de winske fragminten (amplification) fan DNA, sa't it helpt soargje it polymerase keten reaksje yn vitro (yn vitro sûnder belutsenheid fan libbene organisme). As gefolch, de selektearre DNA fragmint fermearet troch dit ketting reaksje, en it bedrach fan DNA tanimt letterlik miljoenen kearen.

De tredde stap yn de molekulêre genetyske ûndersyk metoaden wurdt oannommen fermannichfâldige DNA beheining (dit fersnipeling, skuorre of cutting). Beheining útfierd troch electrophoresis op in polyacrylamide of agarose gel. Dit molekulêre-genetyske metoade fan it bestudearjen fan de DNA-fragmint jout elkenien te nimmen in beskate posysje yn de gel. Dêrnei wurdt de gel wurdt behannele mei ethidium bromide, steat fan bining oan DNA, de irradiation mei Ultraviolet ljocht, dan is it mooglik om te observearje luminescence parten. Molekulêre genetyske diagnostic metoaden binne ôfwikseljend en tal fan, mar de earste twa stappen binne mienskiplik foar allegearre. Mar om te identifisearjen DNA fragminten, it gel kin kleurde, en in protte oare besteande metoaden.

soarten

De meast direkte en wiidferspraat metoaden foar detecting mycobacteria meie ûnder oare de boppesteande molekulêre genetyske DNA learen metoade. Syn essinsje is dat, om te identifisearjen de sykaksje ketting materiaal fan spesifike fragminten fan DNA fan sykteferwekkers. Molekulêre genetyske diagnostic techniken net noch hawwe in mear effisjinte manier te erkennen sokke sykten as tuberkuloaze. It brûken fan de polymerase ketting reaksje (PCR), kinst der wis fan wêze dat de oarspronklike DNA sil tanimme it oantal kopyen yn in miljoen kear, dat wol sizze, der sil wêze amplification, en dat sil de resultaten. De gefoelichheid nivo is hiel heech - mear as fiif en njoggentich prosint, dat is de wichtichste foardiel fan dizze metoade.

De rest fan de molekulêre-genetyske metoaden fan ûndersyk op 'e effektiviteit fan' e opbringst meardere kopyen letterlik ferdûbele, sûnt yn dit gefal it opstellen sample lit in spesifike oligonucleotide sequence ferhege nei ien hûndert en seis kear. Sels de kultuer diagnose fan tuberkuloaze fan de sykhellingsorganen gâns ferleegje syn gefoelichheid. Dit is wêrom't moderne genêskunde is basearre op molekulêre genetyske metoaden fan diagnostyk fan tuberkuloaze. In beskreaun metoade is effektyf foaral by de behanneling fan sykteferwekkers fan hege antigenic fariabiliteit, bepale dat oare manier is folle dreger - fereasket spesjale nutriïnt media en kultivearring lange tiid. Biochemical en molekulêre genetyske metoaden produsearje hiel oars effekt op de resultaten.

diagnoaze fan tuberkuloaze

Marshall PCR diagnoaze fan tuberkuloaze meast mei help fan dy DNA-sekwinsjes dy't spesifyk foar alle fjouwer soarten fan 'e sykte. Om dat te berikken doel faak brûke primers dy't detect sequence IS eleminten (IS-986, IS-6110), lykas dizze eleminten karakterisere tige migratory soarten Mycobacterium tuberculosis en altyd oanwêzich meardere kopyen yn de genome. Ek DNA winning kin wurde útfierd út suver kultueren en Clinical (sputum fan pasjinten) troch in oare geskikt metoade. Bygelyks, der Boom metoade dêr't it lysis buffer brûkt wurdt basearre op it guanidine thiocyanate en silika as de ferfierder DNA. It oantal pasjinten dy't ferskille earme bacteriological groeiend elk jier, en dus yn de klinyske praktyk hat in folslein oar nivo fan organisaasje: molekulêre-genetyske metoade fan studearre DNA is spylje in grutte rol yn de diagnoaze.

Mar, wy moatte tajaan dat it net sûnder skaadkanten. De PCR metoade is it brûken fan faak bringt in grutte tal falske-positive resultaten, en de reden is net allinnich technyske fouten, mar ek de eigenskippen fan 'e metoade sels. Dêrneist mei help fan dizze metoade fan diagnoaze te bepalen de leefberens fan mycobacteria, dy't binne identifisearre, it is gewoanwei ûnmooglik. Mar dit neidiel is net it wichtichste. Molekulêre genetyske metoaden fan PCR diagnostyk inkelde foarm fan it risiko op fersmoarging fan mycobacterial DNA. Sertifisearring easken foar dizze reden dat foar PCR laboratoariums ûntwurpen allinnich hurd, se fereaskje trije ôfsûnderlike pânen. PCR technology is modern en hiel yngewikkeld, it fereasket it gebrûk fan passend apparatuer en hege-oplaat personiel.

bacterioscopy

Doe't de diagnoaze resultaten fan de analyse moat wurde ferlike mei oare gegevens: klinyske ûndersyk, radiography, smeer Mikroskoop, gewaaks en sels reaksje op in spesifike behanneling binne hiel wichtich. Yn dizze rige, de PCR stúdzjes is mar ien fan de komponinten. Detect de pathogen yn 'e iere diagnoaze kin wêze de simpelste en koartste metoaden - bacteriological.

Der wurdt gebrûk makke fan in ljochtmikroskoop (kleurplaat Ziehl-Neelsen) en fluorescent (kleuren fluorochromes). It foardiel is snelheid smeer de resultaten. Mar syn nadeel wurdt terjochte sjoen de beheinde kapasiteit fanwege lege gefoelichheid. Lykwols, dy metoade wurdt jûn WHO Oanrikkemedaasje as de meast ekonomyske en de grûn te spoaren tuberkuloazepasjinten. Opspoaren fan mycobacteria bacteriological metoade hat foarsizzing wearde en skatting kwantitatyf baktearjele útskieding. Folle mear selsbetrouwen om te gean mei it molekulêre genetyske ûndersyk metoaden fan tuberkuloaze.

kulturen

Better opspoaren fan mycobacteria werkenne kulturele stúdzjes. Siedzjen patologysk materiaal it is makke yn it aai medium: Mordovsky, Finn II, LJ, en al sa mear. Peilmerken van weerstand mycobacteria oan medisinen en yndirekte bewiis fan 'e effektiviteit fan in oantal mycobacteria en harren koloanjes yn vitro, as it tapast metoade fan ûndersyk kultuer. Om fergrutsjen it persintaazje isolemint fan mycobacteria inoculation fan patologysk materiaal wurdt holden op meardere omjouwings.

Foldwaan oan de behoeften fan tal fan kulturele, pathogen ynklusyf subsydzje en Fluids. Used in dit systeem en automatisearre Mjit type VANTES groei. Gewaaksen moatte wurde holden yn incubation foar maksimaal sân oant acht wiken. Troch dizze tiid it gewaaks mei it tekoart oan groei kin beskôge negatyf. De meast effektive wize te spoaren Mycobacterium tuberculosis rekken biologyske gebrûk: diagnostysk materiaal infect guinea bargen, dy't ekstreem gefoelich foar tbc.

guon sifers

Nijsgjirrich gebiet fan stúdzje, dat waard iepene troch de PCR diagnostyk wie te bestudearjen fan it M. tuberculosis - latinte ynfeksje. It moderne begryp fan tbc infectie suggerearret dat út fan in hûndert minsken dy't yn kontakt mei M. tuberculosis, en njoggentich meie wol wurde besmetten, mar by mar tsien fan harren binne aktyf sykte wurdt ûntwikkele. Oaren hawwe TB immuniteit, en om't njoggentich persint fan de gefallen de ynfeksje bliuwt latinte. Detect in patroan dat hat holpen in molekulêre genetysk metoade.

Geneticists sizze dat fyftich-fiif prosint fan dyjingen waans gewaaksen patologysk materiaal wienen negatyf, en tachtich persint fan de minsken besmet mei M. tuberculosis, mar oerrinnende fen gjin radiographic uteringen fan sykte, PCR positive reaksjes krigen. It is in genetyske diagnostyske metoade holp te identifisearjen pasjinten by risiko troch PCR stúdzjes, mei de útkomsten fan harren analyzes (Mikroskoop en kultuer) waarden negatyf, en subclinical ynfeksje M. tuberculosis wie oanwêzich.

modern ûndersyk

De Russyske Federaasje en bacteriological laboratoariums brûke in flugger metoade fan absolute konsintraasjes: nitrate reductase aktiviteit fan mycobacteria test troch Griess reagent. Anti-TB sintra brûke in metoade wêrmei te bepale drug ferset. Dit Seeding yn floeibere media, dêr't automatysk radiometric en fluorescent boekhâlding systeem groei fan mycobacteria. Sa'n analyze wurdt dien gau - maksimaal twa wiken.

Op it stuit, nije metoaden wurde ûntwikkele: drug wjerstân fan mycobacteria wurdt metten oan de genotype nivo. Stúdzje fan de molekulêre meganismen fan ferset genen en toant de oanwêzigens yn mycobacteria. Dizze genen wurde yn ferbân brocht mei wjerstân tsjin bepaalde drugs. Bygelyks, Kasa genen, Inha, katG resistint te isoniazid, rpoB gen - rifampicin 16Sp RNA genen en rpsL - streptomycine, emb1 - ta ethambutol, gyrA - een fluoroquinolone ezh.

mutaasjes

De moderne diagnoaze gâns tanommen de molekulêre-genetyske nivo metoade foar stúdzje DNA en meie fieren grutskalige stúdzjes fan mutaasjes yn al harren spektrum. No witte wy dat de meast foarkommende mutaasjes yn 'e 516, 526 en 531 codons it rpoB gen, en identifisearre de wjerstân oan ferskate drugs. Der is in hiele skala fan metoaden foar it typen fan mycobacteria mei help net allinne tradisjonele metoaden - biochemical, biologyske en kultureel, mar ek in soad brûkt moderne molekulêre genetyske techniken. Al binne der genôch en soargje foar de goede diagnoaze metoade foar it opspoaren fan monogenic syktes. Se binne basearre op DNA stúdzjes yn de eksakte gebiet fan in bepaald gen. Dit is meastal in kompleks proses, tiid tiidslinend en djoer, mar de gegevens dy levere wurdt troch de molekulêre genetyske analyze, is folle krekter en ynformative as de gegevens fan alle oare analyzes.

It hat lang al bekend dat it DNA net feroaret foar it hiele libben fan it organisme, dat it is yn alle nucleated sellen odnakova, en dit makket it mooglik om te nimmen de analyze fan absolút alle sellen fan it lichem, op elk stadium fan ontogeny. It beskeadige gene kin opspoard foardat it uterlik fan 'e earste symptomen oan de folsleine-skaal klinyske sykte, likegoed as yn sûn heterozygous minsken, mar mei in mutaasje yn it gen. Molekulêre genetyske erflike sykte diagnostyske metoaden tastean om reveal har (direkte oanpak, DNA-diagnostyk), en ek om te analysearjen de segregaasje fan de sykte yn 'e húshâlding fan marker Plak yn DNA (genetyske polymorphisms), dy't binne nau ferbûn mei in beskeadige gen (dat wol sizze, de yndirekte oanpak fan DNA-diagnostyk). Direkt of yndirekt - eltse DNA diagnoaze is basearre op 'e metoaden fan it oanwizen fan in strang omskreaun part fan' e minsklike DNA.

direkte metoaden

Direkte metoaden fan DNA diagnoaze binne doe't de dieder gene erflike sykte wurdt bekend, lykas bekend, en typen fan syn mutaasjes. Bygelyks, in passende direkte metoades yn in oantal sykten. Dit Huntington syn chorea (extension CTG-werhellet), phenylketonuria (R408W), Cystic fibrosis (delF508, grutte mutaasjes) en al sa mear. It wichtichste foardiel fan de direkte metoade is in folslein-eigendom diagnostyske krektens, en der is gjin ferlet te dwaan in DNA analyse fan 'e rest fan' e famylje. As in mutaasje yn de oerienkommende gene wurdt fûn, It stiet krekt goedkarre in diagnose fan 'e oererving genotype fêststelling foar de rest fan' e teheistere famylje.

In oar foardiel fan de direkte diagnoaze wurdt beskôge te identifisearjen in heterozygous drager fan minne mutaasjes út famyljeleden en âlden dy't stoar út 'e sykte. Dat jildt benammen foar sykten autosomal recessive. Neidielen fan direkte metoaden ek beskikber binne. Om tapasse ha, dan moatte witte krekt localize de ôfwikende gene, exon-intron struktuer fan syn spektrum en syn mutaasjes. Net alle monogenic sykten hjoed hawwe krigen sokke ynformaasje. Informativeness direkte metoaden kinne net beskôge kompleet, omdat ien en deselde gene meie hawwe in grut oantal patologysk mutaasje dy't soarget ûntwikkeling fan erflike sykten.

yndirekte metoaden

Yndirekte metoaden in DNA diagnostyk wurde brûkt om alles, yn oare gefallen, as it beskeadige gene is net identifisearre, mar allinne chromosomally, of as de line diagnose net jaan het resultaat (dat bart, as it gen komplekse molekulêre organisaasje of in grut part, as der in protte syklike mutaasjes). Yndirekte metoaden útfierd segregaasje analyze fan polymorphic stiften yn allelic famylje. Markers fûn yn deselde chromosomal regio of locus is nau ferbûn mei de sykte en it fertsjintwurdigjen wat wiske of insertions, punt wiksels, werhellet, en harren polymorphism komt troch ferskate bedrach fan sellen yn it blok.

Meast handige foar yndirekte diagnostyk beskôge microsatellite en minisatellite polymorphisms, dy't in soad ferspraat yn 'e minsklike genome. harren wearde útdrukt yn hege ynformaasje ynhâld, as skea oan de genetyske ôfstân tusken de marker en it gen is net te grut. Yn dat lêste gefal, de ynskatting accuracy wurdt fêststeld foar in grut part de frekwinsje fan Rekombinaasje tusken de polymorphic marker en skea. Yndirekte diagnostic metoaden ek biede ferplichte foarriedige stap fan allele frekwinsjes fan de analysearre befolking ûndersyk ûnder pasjinten en dragers fan mutaasjes, plus de needsaak fan it fêststellen fan de kâns op Rekombinaasje fan nonequilibrium en adhesion stiften en Mutant alleles.

oare metoaden

Koarte segminten fan RNA of DNA, likegoed as single gene visualized ûnder mikroskopyske stúdzje kin net wêze, dêrom, te identifisearjen mutaasjes nedich troch de molekulêre genetyske diagnoaze. Der is in "Human genome Project", lykas ek oare foarútgong yn molekulêre Genetyske Sintrums sterk útwreide de mooglikheid fan de diagnoaze fan erflike sykten - sawol foarskoalsk en postnatal. Dy metoaden kinne leverje betide sinjalearring en meitsje in foarsizzing poly- en monogenic syktes, waans debút fynt plak op in lette middei. Spitigernôch, fanwege de technyske mooglikheden fan molekulêre genetyske stúdzjes binne soms fierder as de etyske grinzen dy't ynsteld yn relaasje ta erfskip, benammen as de diagnoaze is yn adolesinsje en bernetiid.

Strukturele en numerike chromosomal ôfwikings binne de meast foarkommende oarsaken fan sykte en kanker, en in protte malformations. Chromosomal aberrations moatte wurde identifisearre, dat is wichtich foar famylje begelieding - te beoardieljen de Sage, tegearre mei reproductive risiko yn takomstige swier. Gromosoom analyse is de "gouden standert" fan genetysk diagnoaze, mar it is beheind. Allinne de metoaden fan de molekulêre genetyske analyze kin mear dwaan, omdat der brûkt cloning technology basearre fluorescent labels steat fan harren hege gefoelichheid te identifisearjen subtile chromosomal feroarings dy't ûnmooglik te spoaren klassike cytogenetic stúdzjes. Dy techniken binne hieltyd útwreidzjende ús diagnostyske mooglikheden, doe't ûndersocht, bern mei ûntwikkelingssteurnissen beheining, mentale retardaasje, mei in soad oare erflike sykten.

befinings

It is hiel wichtich foar de minske wiene it gen struktuer en funksje fan kennis, soarten fariabiliteit, it fermogen om te spoaren erflike sykten dy't barde yn ferbân mei it ûntwikkeling fan de molekulêre Genetika. syn metoades wurde rjochte op 'e stúdzje fan' e DNA molecule - en as it is normaal, en as it wurdt skansearre. Tarieding fan deoxyribonucleic acid sekwinsjes fan nucleotides (DNA) wreidet yn stadia fan ûntfangst fan gebrûk te identifisearjen yndividuele fragminten. Isolation fan genomic DNA út de sellen, beheining (ferskuorst), amplification (cloning), electrophoresis fan de fragminten (skieden harren elektryske lading en molekulêre gewicht troch agarose gel). Identifikaasje fan spesifike fragminten leit oan it oerflak fan in diskrete stripe.

Dan krije yn de die spesjale filters, troch dat giet elk fragmint hybriden mei cloned DNA fragminten of syntetyske radioaktive sûnden is in kontrôle, dat sil wêze gelyk oan elke test sample. As jo feroarje de posysje of lingte fergelike mei de sonde, as in nije fragmint of ferdwûn - alles dat suggerearret dat it analysearre gene hat ûndergien werstrukturearring yn de nucleotide folchoarder. Der binne acht basis techniken fan molekulêre genetyske stúdzjes: sequencing (fêststellen fan DNA sequence), polymerase ketting reaksje (tanimmen fan it tal sekwinsjes), de tarieding fan primers bekende genen, DNA cloning, produksje fan recombinant molekulen ôflate aaiwiten fanwege recombinant molekulen, it meitsjen fan in folsleine set (kolleksje library) cloned fragminten dy't waarden krigen troch gebrûk fan beheining.